کشت سلول چیست؟

کِشت سلولی (Cell Culture) یعنی رشد و تکثیر سلولهای زنده‌ یوکاریوتی (انسانی، حیوانی یا گیاهی) در یک محیط مصنوعی و کاملا کنترل ‌شده خارج از بدن  (in vitro). در این شرایط، سلولها داخل ظروف کشت قرار می‌گیرند و با محیط کشت مناسب تغذیه می‌شوند؛ محیطی که از نظر مواد مغذی و شرایط فیزیکی – شیمیایی به وضعیت درون تنی(in vivo) مشابه تر است.

اهمیت کشت سلولی در این است که به جای کار با یک سیستم پیچیده‌ی بدن، شما می‌توانید رفتار سلول را مستقیم و قابل‌تکرار بررسی کنید؛ از مطالعه سرطان و ژن ‌درمانی گرفته تا غربالگری دارو و تولید محصولات زیستی.

 

مراحل کشت سلولی

مراحل کشت سلولی به ‌طور کلی با آماده‌ سازی محیط کشت و ظروف استریل شروع میشود. در صورتی که ترجیح میدهید از محیط کشت آماده مصرف استفاده کنید و مرحله آماده سازی محیط کشت را به سرعت پشت سر بگذارید، فروشگاه نیکو با ارائه انواع محیط کشت روند کشت سلول را سریعتر میکند. سپس سلول‌ ها (از بافت یا یک رده سلولی) کاشت میشوند و در شرایط کنترل‌ شده‌ انکوباتور قرار می‌گیرند تا رشد کنند. طی این مدت، کشت به‌ صورت منظم پایش میشود و در صورت نیاز محیط تعویض می‌گردد. وقتی تراکم سلول‌ ها بالا رفت، با پاساژ/زیرکشت سلولها به ظرف جدید منتقل میشوند تا رشد ادامه پیدا کند و در نهایت، در صورت نیاز برای استفاده‌ های آینده ذخیره‌ سازی (فریز/بانک سلولی) انجام می‌شود. پلیت یکبار مصرف 8 سانت یکی از محیط کشت های پر مصرف است و میتوانید از سایت تهیه کنید.

 

به ‌طور مختصر مراحل کشت سلولی به شرح زیر است:

• آماده‌ سازی محیط کشت: انتخاب و آماده‌ سازی محیط کشت مناسب برای رده سلولی مورد نظر.
• جداسازی سلول‌ها: استخراج سلول‌ ها از بافت یا تهیه رده سلولی.
• کاشت سلول‌ها یا Seeding: انتقال سلول‌ ها به ظرف کشت و افزودن محیط کشت.
• انکوباسیون: قرار دادن سلول‌ها در انکوباتور با شرایط کنترل‌ شده دمایی و …
• پایش رشد: نظارت بر رشد سلول‌ ها و بررسی مورفولوژی.
• پاساژ یا ساب‌ کالچر: انتقال سلول‌ها به ظرف جدید برای ادامه رشد (در صورت نیاز).
• نگهداری و فریز کردن: ذخیره‌سازی سلول‌ها برای استفاده‌های بعدی (در صورت نیاز).

 

 

مواد تشکیل دهنده محیط کشت

محیط کشت‌های میکروبی معمولا از یک ماده مغذی (پپتون/تریپتون یا مخمر) برای تأمین نیتروژن، ویتامین‌ها و فاکتورهای رشد، نمک‌ و بافرها (برای تعادل یونی و pH)، منبع انرژی (مثل قندها)، و در صورت نیاز عامل جامد کننده مثل آگار تشکیل می‌شوند؛ علاوه بر این، بسته به هدف، ممکن است مواد غنی‌ کننده (مثل خون/سرم)، مواد انتخابی (مثل نمک‌ های صفراوی، رنگ‌ ها یا آنتی‌بیوتیک‌ ها برای مهار میکروب‌ های ناخواسته)، و مواد افتراقی/شاخص‌ ها (مثل اندیکاتورهای pH یا ترکیبات نشان‌ دهنده تولید گاز/H₂S) هم به آن اضافه شود.

 

تفاوت انواع محیط کشت در چیست؟

تفاوت اصلی محیطهای کشت در «هدف طراحی» آنهاست: بعضی محیط‌ ها فقط برای رشد عمومی هستند (general purpose)، بعضی غنی‌ شده‌ اند تا میکروب‌ های سخت‌ گیر بهتر رشد کنند (enriched)، برخی انتخابی هستند تا گروهی از میکروب‌ ها را رشد دهند و بقیه را مهار کنند (selective)، و بعضی افتراقی ‌اند تا با تغییر رنگ یا واکنش‌ های بیوشیمیایی، گونه‌ ها را از هم تفکیک کنند (differential).

برای مثال محیط کشت شکلات آگار یک محیط غنی‌ شده است؛ چون با افزودن خونِ گرم‌ شده (لیز شده) فاکتورهای رشد آزاد می‌شود و برای رشد باکتری‌ های حساس مناسب‌ تر است. اما  محیط کشت TSI  آگار یک محیط افتراقی است که با داشتن قندها، شاخص pH و اجزای نشان‌ دهنده H₂S، به شما کمک می‌کند الگوی تخمیر قندها، تولید گاز و H₂S را ببینید و بین باکتری‌های گرم منفی روده‌ تمایز ایجاد کنید.

 

عوامل موثر در کشت سلولی

در کشت سلولی، متغیرهایی مثل دما، pH، رطوبت و ترکیب گازها به‌ویژه CO₂)) باید پایدار بمانند؛ چون کوچکترین نوسان در این عوامل می‌تواند رشد و پاسخ‌ سلولی را تغییر دهد.علاوه بر این در کشت‌ سلول پستانداران، شرایط رایجی مانند دمای ۳۷° و حاکثر۵٪ CO₂ اشاره می‌شود (بسته به نوع محیط و سیستم بافری).

 

 

پاساژ سلولی چیست؟

پاساژ سلولی (Subculture / Passaging) یعنی انتقال سلول‌ها از یک ظرف کشت به ظرف جدید با محیط تازه تا سلول‌ها فضای کافی و مواد مغذی مناسب برای ادامه رشد داشته باشند. این کار عملاً تمدید عمر کشت و حفظ سلول‌ها در وضعیت رشد مطلوب است.

 

عوامل موثر در پاساژ سلولی

اگر محیط کشت بیش از حد متراکم شود Confluence بالا برود یا محیط کشت «مصرف‌شده» باشد، سلول‌ها ممکن است از فاز رشد فعال خارج شوند، کیفیت و مورفولوژی‌شان تغییر کند و نتایج آزمایش‌ ناپایدار شود. به همین دلیل، منابع فنی توصیه می‌کنند پاساژ زمانی انجام شود که سلول‌ها در فاز رشد مناسب و با زنده‌مانی (viability) خوب باشند.

 

شماره پاساژ در کشت سلولی چیست؟

شماره پاساژ (Passage Number) یعنی تعداد دفعاتی که یک کشت به ظرف جدید منتقل شده است و دلیل اهمیت آن این است که با افزایش پاساژ، سلول‌ها ممکن است به ‌تدریج تغییرات فنوتیپی/ژنتیکی نشان دهند و این موضوع روی قابلیت تکرارپذیری داده‌ها اثر می‌گذارد. به همین دلیل، ثبت دقیق شماره پاساژ و مدیریت آن یکی از اصول کنترل کیفیی در کار با رده‌ های سلولی است.

 

برای کسب اطلاعات بیشتر درباره محیط کشت و انواع آن این مقاله را مطالعه کنید: محیط کشت چیست؟

 

انواع کشت سلولی

انواع کشت سلولی شامل کشت اولیه و رده‌های سلولی است؛ و این کشت‌ها از نظر شیوه انجام می‌توانند به صورت دو‌بعدی (2D) یا سه ‌بعدی (3D) و همچنین به شکل چسبنده (Adherent) یا تعلیقی (Suspension) اجرا شوند.

 

کشت اولیه  (Primary Culture)و کشت ثانویه ((Secondary Culture

کشت اولیه زمانی ایجاد می‌شود که سلول‌ها مستقیماً از بافت جدا می‌شوند و در آزمایشگاه شروع به رشد می‌کنند. این سلول‌ها معمولاً به وضعیت طبیعی بدن نزدیک‌ترند، اما بدلیل حساسیت بالای آنها معمولاً عمر تکثیر محدودی دارند.

در ادامه این سلول‌ها معمولاً به کشت ثانویه (Secondary culture) منتقل می‌شوند، جایی که سلول‌ها تحت شرایط جدید و در ظروف تازه برای ادامه رشد یا تحت آزمایش‌های خاص کشت داده می‌شوند. کشت ثانویه، در واقع مرحله بعد از کشت اولیه است و و نتیجه ی پاساژ سلولی به حساب میاد.

 

رده سلولی  (Cell Line)

وقتی یک کشت اولیه برای اولین بار با موفقیت پاساژ داده می‌شود، عملاً وارد محدوده‌ی رده‌های سلولی می‌شود. رده‌های سلولی معمولاً پایدارتر و تکرارپذیرتر هستند و کار روزمره آزمایشگاهی را آسان‌تر می‌کنند (البته هر رده، ویژگی‌ها و محدودیت‌های خودش را دارد).

 

کشت چسبنده و کشت تعلیقی

کشت چسبنده (Adherent culture) یعنی سلول‌ها برای زنده‌ ماندن و تکثیر، باید به یک سطح جامد بچسبند (مثل کف فلاسک یا پلیت). این سلول‌ها معمولاً به شکل تک‌لایه (Monolayer) رشد می‌کنند و با افزایش تراکم، سطح را پر می‌کنند. خیلی از سلول‌های مشتق از بافت‌ها (مثل سلول‌های اپی‌تلیال، فیبروبلاست‌ها و بسیاری از رده‌های سرطانی) این‌طور رفتار می‌کنند. در این نوع کشت، کیفیت سطح ظرف و پوشش‌های سطحی (وقتی لازم باشد) می‌تواند روی چسبندگی، شکل سلول و حتی نتیجه آزمایش اثر بگذارد.

کشت تعلیقی (Suspension culture) یعنی سلول‌ها به سطح نمی‌چسبند و در محیط شناور هستند. رشدشان به صورت تجمع‌های کوچک یا پراکنده در مایع اند. این مدل برای سلول‌هایی که ذاتاً در مایعات بدن زندگی می‌کنند (مثل خیلی از سلول‌های خونی) یا رده‌هایی که برای رشد معلق سازگار شده‌اند رایج است. در کشت تعلیقی، مهم‌ترین نکته کنترل تراکم سلولی و یکنواختی سوسپانسیون است.

 

کشت دو بعدی و سه‌ بعدی (2D & 3D) و تفاوت آنها

کشت دو‌بعدی (2D) یعنی سلول‌ها روی یک سطح صاف مثل کف فلاسک یا پلیت رشد می‌کنند و معمولاً یک لایه نازک (monolayer) می‌سازند. کشت سه‌بعدی (3D) یعنی سلول‌ها در یک حجم رشد می‌کنند (رشد و سازمان‌دهی سلولی در سه بُعد (طول، عرض، عمق) اتفاق می‌افتد) مثلاً به‌ صورت اسفروئید/ارگانوئید یا داخل هیدروژل و داربست، طوری که ارتباط سلول ‌با ‌سلول و سلول ‌با‌ ماتریکس شبیه‌تر به بافت واقعی شود.

تفاوت اصلی کشت دو بعدی و سه‌ بعدی این است که کشت دو بعدی ساده‌تر، ارزان ‌تر و استاندارد تر است و برای بسیاری از تست‌ها کفایت میکند؛ اما کشت سه‌ بعدی معمولاً فیزیولوژیک ‌تر است (شرایطی تقریبا درون تنی را شبیه سازی میکند) و به این دلیل پیچیدگی بیشتر و تحلیلش سخت‌ تری نیاز دارد.

 

 

آلودگی کشت سلولی چرا رخ میدهد؟

آلودگی کشت سلولی یکی از مشکلات رایج است که می‌تواند نتایج آزمایش‌ها را تحت تأثیر قرار دهد. این آلودگی‌ها شامل باکتری‌ها، قارچ‌ها، مایکوپلاسما و آلودگی متقاطع هستند. مایکوپلاسما به‌خصوص می‌تواند بدون علامت واضح رشد کند و بر نتایج تاثیر بگذارد. برای جلوگیری از آلودگی، باید اصول کار آسپتیک رعایت شود، محیط کشت به‌طور منظم تعویض شود و پایش‌های دوره‌ای انجام گیرد. استفاده از مواد ضدعفونی‌کننده و آنتی‌بیوتیک‌ها نیز می‌تواند به کاهش آلودگی کمک کند.

 

مایکوپلاسما چیست و چه نقشی آن در آلودگی کشت سلولی

مایکوپلاسما (Mycoplasma) گروهی از باکتری‌های بسیار ریز و بدون دیوارهٔ سلولی هستند که می‌توانند به‌ صورت پنهان کشت‌های سلولی را آلوده کنند؛ یعنی ممکن است بدون کدورت واضح یا بوی غیرعادی، مدت‌ها در کشت باقی بمانند و در همان حال با تغییر متابولیسم، رشد، بیان ژن و پاسخ‌های سلول، نتایج آزمایش را غیرقابل اعتماد کنند.

 

برای انتخاب محیط کشت مناسب کشت سلولی بهتر است قبل از انجام کشت مقاله مقایسه انواع محیط کشت را مطالعه نمایید.

 

سوالات متداول

تفاوت کشت اولیه و رده سلولی چیست؟

کشت اولیه از بافت تازه می‌آید و معمولا از نظر فیزیولوژیک طبیعی‌ تر است، اما حساس‌تر و کوتاه‌عمرتر است. رده‌ های سلولی برای کارهای تکرارپذیر و روتین مناسب‌ترند، اما ممکن است با گذر زمان دچار تغییرات تدریجی شوند و همیشه باید اصالت و شرایط نگهداری‌شان مدیریت شود.

 

بهترین روش جلوگیری از مایکوپلاسما در کشت سلول

بهترین رویکرد، پیشگیری سیستماتیک است: رعایت اصول کار آسپتیک، مدیریت صحیح مواد مصرفی، کاهش ریسک انتقال بین کشت‌ها، و انجام تست‌های دوره‌ای. منابع معتبر تاکید می‌کنند که شناسایی زودهنگام و پایش روتین، کلید کنترل این آلودگی است.

 

هر چند وقت یک‌بار باید مایکوپلاسما را چک کرد؟

بسته به حساسیت پروژه و سیاست کیفیت، معمولاً پایش دوره‌ای توصیه می‌شود.

 

تفاوت کشت اولیه و ثانویه در چیست؟

کشت اولیه مستقیماً از بافت زنده جدا شده و بیشترین شباهت را به سلول‌های بدن دارد، اما طول عمر آن کوتاه است. کشت ثانویه از انتقال (پاساژ) سلول‌های قبلی به ظرف جدید حاصل می‌شود که رشد سریع‌تر و عمر طولانی‌تری دارد.