طرز تهیه محیط کشت جامد یکی از مهم ترین مراحل در کار میکروبیولوژی است؛ چون کیفیت هر محیط کشت مستقیم ترین تاثیر را روی رشد میکروارگانیسم، نتایج آزمون و قابل اعتماد بودن داده ها دارد. اگر محیط کشت درست حل نشود، غلظت آگار استاندارد نباشد، pH به محدوده توصیه شده نرسد یا در زمان استریلیتی خطایی ایجاد شود، خروجی نهایی آزمایش ممکن است کاملا تغییر کند و حتی یک آزمایش ساده، دوباره کاری و اتلاف وقت به همراه داشته باشد. به همین دلیل یادگیری اصول درست آماده سازی محیط کشت جامد نه یک مهارت اضافه، بلکه یک ضرورت برای هر آزمایشگاه میکروبی است؛ مخصوصا در آزمایشگاه هایی که دقت، باز تولید پذیری و کنترل کیفیت اهمیت بالایی دارد.
در این راهنما، مراحل تهیه محیط کشت جامد را از وزن کردن پودر و حل کردن کامل آگار گرفته تا تنظیم pH، اتوکلاو، خنک کردن، افزودن مواد حساس به حرارت، ریختن در پلیت و اجرای کنترل کیفیت بررسی می کنیم. در کنار این مراحل، نکات مهمی درباره پیشگیری از آلودگی، خطاهای رایج، تفاوت محیط های آماده مصرف با محیط های تهیه دستی و زمان مناسب استفاده از هر کدام نیز توضیح داده شده است. این مقاله به گونه ای نوشته شده که برای تکنسین تازه کار، کارشناس کنترل کیفیت، مسئول آزمایشگاه و حتی کاربرانی که برای اولین بار با محیط های میکروبی سروکار دارند، کاملا قابل فهم و کاربردی باشد.
در بسیاری از آزمایشگاههای میکروبی، نتیجه آزمایش تنها به کیفیت نمونه یا دقت تکنسین وابسته نیست؛ کیفیت محیط کشت نیز نقش تعیین کننده ای دارد. اگر محیط کشت جامد به درستی وزن، حل، استریل یا در پلیت ریخته نشود، ممکن است با نتایج غیرقابل اعتماد، رشد ناکافی یا آلودگی پس زمینه مواجه شویم و ناچار به تکرار آزمون ها گردیم.
به همین دلیل، آشنایی با طرز تهیه محیط کشت جامد بر اساس دستورالعمل سازنده، رعایت اصول استریلیتی و اجرای حداقل کنترل کیفیت)مانند بررسی pH و رشد میکروارگانیسم‌ها (برای هر آزمایشگاهی ضروری است؛ حتی اگر در بسیاری از موارد از محیط‌های آماده مصرف استفاده شود.
مواد و تجهیزات مورد نیاز برای تهیه محیط کشت جامد
پیش از شروع آماده سازی، باید مواد و تجهیزات لازم فراهم باشد تا فرآیند بدون وقفه و با حداقل ریسک آلودگی انجام شود. به طور معمول برای تهیه یک محیط کشت جامد (مثلاً نوترینت آگار یا هر محیط آگاردار عمومی دیگر) به موارد زیر نیاز است:
-
- پودر محیط کشت (Dehydrated culture media) مطابق با نوع محیط مورد نظر
- آب مقطر یا دیونیزه با کیفیت مناسب
- بالانس دقیق آزمایشگاهی برای وزن‌کردن پودر
- بالن، ارلن یا بیکر مقاوم به حرارت
- منبع حرارت (هات‌پلیت با مگنت، یا بن‌ماری)
- اتوکلاو برای استریلیتی
- پلیت شیشه ای یا پلیت یکبار مصرف 8 سانت
- در صورت نیاز، مواد افزودنی(مثلا خون یا آنتی بیوتیک) که پس از استریلیتی اضافه میشوند
مرحله اول: وزن‌کردن پودر محیط کشت
اولین و مهمترین نکته در طرز تهیه محیط کشت جامد این است که دقیقاً طبق برچسب و دستورالعمل سازنده عمل کنید. روی هر قوطی پودر محیط کشت معمولاً ذکر شده است که چه مقدار پودر برای چه حجمی از آب لازم است (مثلا ۲۸ گرم در یک لیتر آب). پودر باید ابتدا کالیبره شده و در محیط نسبتاً خشک وزن شود. بهتر است پودر مورد نیاز برای هر نوبت آماده سازی را جداگانه وزن شود.
مرحله دوم: حل کردن پودر در آب مقطر
پس از وزن کردن، مقدار مناسب آب مقطر یا دییونیزه را در ارلن یا بالن ریخته و پودر را به‌آرامی به آن اضافه می‌کنیم. بهتر است در هنگام اضافه‌کردن، نمونه را به‌طور پیوسته هم بزنیم تا پودر به صورت یکنواخت پخش شود.
در اغلب دستور العمل ها توصیه میشود محلول روی هات‌پلیت با همزن مغناطیسی یا در بن ماری گرم شود تا ذرات آگار و سایر ترکیبات کاملاً حل شوند. محلول در نهایت باید شفاف یا به رنگ مشخص و یکنواخت برسد و رسوب قابل مشاهده نداشته باشد.
مرحله سوم: تنظیم حجم و بررسی pH (در صورت نیاز)
پس از حل شدن کامل پودر، حجم محلول را (در صورت تبخیر) مجددا به حجم مورد نظر (مثلاً یک لیتر) برسانید. در آماده‌سازی روتین، معمولاً اگر از آب استاندارد استفاده شده و مقدار پودر مطابق دستور بوده است، نیاز به تنظیم pH وجود ندارد؛ اما در صورت لزوم، میتوان پیش از اتوکلاو با استفاده از NaOH یا HCl رقیق و pH متر، pH را در محدوده توصیه‌شده تنظیم کرد.
مرحله چهارم: استریلیتی در اتوکلاو
گام بعدی، استریلیتی محیط کشت است. ارلن حاوی محیط کشت حل‌شده باید با پنبه و فویل یا درب مقاوم پوشانده شود تا از ورود آلودگی جلوگیری شود ولی امکان خروج بخار هنگام اتوکلاو فراهم باشد.
بیشتر محیط‌های آگاردار در ۱۲۱ درجه سانتی‌گراد به مدت ۱۵ دقیقه در فشار ۱ اتمسفر ( ۱۵ psi )اتوکلاو میشوند. زمان و شرایط دقیق اتوکلاو ممکن است با توجه به حجم و نوع محیط کمی متفاوت باشد، اما پیروی از مقدار توصیه‌شده توسط سازنده و SOP داخلی آزمایشگاه ضروری است. پس از پایان سیکل، محیط باید به تدریج و بدون شوک دمایی سرد شود.
مرحله پنجم: خنک‌کردن و افزودن مواد حساس به حرارت (در صورت نیاز)
پس از خروج ارلن از اتوکلاو، محیط هنوز داغ و در حالت مایع است. معمولا توصیه میشود محیط تا حدود ۴۵–۵۰ درجه سانتی‌گراد خنک شود؛ دمایی که هنوز آگار مایع است ولی آن‌قدر داغ نیست که باعث تخریب مواد حساس به حرارت شود.
در این مرحله، اگر محیط شما نیاز به افزودن موادی مانند خون، سرم، آنتی بیوتیک ها، فاکتورهای رشد یا نشانگرهای خاص دارد، باید آنها را تحت شرایط استریل (مثلا در هود لامینار) به محیط اضافه و به خوبی مخلوط کنید. برای مثال برای تهیه محیط کشت بلاد آگار, از محیط پایه حاوی آگار و افزودن خون استریل شده استفاده میشود.
مرحله ششم: ریختن محیط در پلیت و جامد شدن
در ادامه، محیط مایع تحت شرایط استریل (ترجیحا در هود لامینار یا نزدیک شعله بنزن) در پلیت های پتری ریخته میشود. معمولا برای پلیت های استاندارد ۹ سانتی متری، حدود ۱۸ تا ۲۰ میلی لیتر کافی است تا ضخامت مناسبی ایجاد شود و در آزمون هایی مثل کشت خطی یا تست حساسیت آنتی بیوتیکی، نتیجه قابل اعتماد حاصل کند.
پس از ریختن محیط، پلیت ها را روی سطح صاف قرار دهید تا به طور یکنواخت جامد شوند. بهتر است در چند دقیقه اول درِ پلیت ها نیمه باز یا کمی روی هم قرار گیرد تا بخار اضافی خارج شود و قطرات آب روی سطح آگار جمع نشود. بعد از جامد شدن کامل، پلیت ها را وارونه (در به سمت پایین باشد) در یخچال یا سردخانه ذخیره می‌کنند تا از چکه کردن احتمالی آب روی سطح آگار جلوگیری شود.
مرحله هفتم: برچسب‌گذاری و نگهداری
هر پلیت یا دسته ای از پلیت ها باید برچسب واضح داشته باشد: نوع محیط، تاریخ آماده سازی، شماره بچ یا کد آماده سازی و در صورت لزوم، تاریخ انقضا. دمای نگهداری معمولا بین ۲ تا ۸ درجه سانتی گراد است، مگر آنکه سازنده مقدار متفاوتی را قید کرده باشد.
پلیت‌های آماده شده نباید در معرض نور مستقیم، گرمای زیاد یا خشک‌شدن قرار بگیرند. همچنین از استفاده از پلیت‌هایی که سطح آنها خشک، ترک‌خورده، آلوده یا دارای رشد ناخواسته هستند باید خودداری شود.
مرحله هشتم: کنترل کیفیت (QC) و آزمون قابلیت رشد میکروبی
برای آزمایشگاه‌هایی که تحت الزامات رگولاتوری و استاندارد (مانند ISO/IEC 17025 یا اصول GMP فعالیت می‌کنند، لازم است بر روی هر بچ، کنترل کیفیت پایه نیز انجام شود.
این کنترل میتواند شامل موارد زیر باشد:
- بررسی ظاهری: رنگ، شفافیت، عدم وجود رسوب، ترک یا آلودگی
- اندازه گیری pH یک یا چند پلیت
- آزمون قابلیت رشد میکروبی (GPT) با استفاده از سویه های مرجع مناسب؛ به این صورت که یک سویه شناخته شده روی محیط کشت قرار داده میشود و بررسی میشود که آیا رشد قابل قبول و ویژگیهای مورد انتظار (مثلاً رنگ کلنی، همولیز، تخمیر قند) مشاهده میشود یا خیر.
تهیه محیط کشت جامد یا محیط کشت آماده
اما آیا منطقی است که برای انجام آزمایشات تهیه محیط کشت جامد به صورت دستی انجام شود؟ چه زمانی به جای تهیه دستی، استفاده از محیط کشت آماده منطقی تر است؟
هرچند آشنایی با طرز تهیه محیط کشت جامد برای هر آزمایشگاه ضروری است، اما در عمل بسیاری از مراکز، به ویژه آزمایشگاههای شلوغ یا تحت استاندارد، برای بخشی از نیاز خود از محیط های آماده مصرف استفاده می‌کنند.
این کار زمانی رخ میدهد که:
- حجم نمونه بالاست و زمان آماده سازی محدود است
- اتوکلاو یا امکانات کنترل کیفیت کافی در دسترس نیست
- محیط، ترکیب پیچیده یا حساس (مثلاً حاوی خون، آنتی‌بیوتیک یا مواد انتخابی قوی) دارد
- لازم است مستندات کنترل کیفیت و GPT از تولیدکننده در پرونده موجود باشد
سوالات متداول
۱. اگر پودر محیط کشت را کمی بیشتر یا کمتر از مقدار توصیه‌شده اضافه کنیم، چه مشکلی پیش می‌آید؟
تغییر در مقدار پودر میتواند به تغییر غلظت آگار، pH و مواردی از این قبیل منجر شود. این مسئله ممکن است باعث شود محیط بیش از حد سفت یا نرم شود، رشد برخی میکرو ارگانیسم‌ها کاهش یابد یا نتایج افتراقی (مثلاً رنگ کلنی‌ها) دچار اختلال گردد.
۲. آیا همیشه لازم است pH محیط قبل از اتوکلاو تنظیم شود؟
اگر از آب مقطر مناسب استفاده شده و مقدار پودر دقیق است، در بسیاری از محیط‌های استاندارد نیازی به تنظیم pH نیست و pH نهایی در محدوده توصیه شده قرار می‌گیرد. با این حال، در محیط هایی که pH آنها حساس است یا در آزمایشگاههای تحت استاندارد بین المللی مانند فروشگاه نیکو، ممکن است اندازه گیری و در صورت لزوم تنظیم pH قبل از اتوکلاو طبق SOP داخلی الزامی باشد.
۳. چرا افزودن خون یا آنتی‌بیوتیک باید بعد از اتوکلاو انجام شود؟
خون، برخی آنتی‌بیوتیک‌ها و مواد حساس دیگر در دمای بالای اتوکلاو تجزیه یا غیرفعال میشوند. به همین دلیل، ابتدا محیط پایه استریل میشود و سپس پس از خنک شدن تا دمای مناسب (معمولاً ۴۵–۵۰ درجه سانتی‌گراد)، مواد حساس به حرارت تحت شرایط استریل به آن اضافه می‌گردد.
۴. تا چه مدت میتوان پلیت های آماده شده را نگهداری کرد؟
مدت نگهداری به نوع محیط، شرایط بسته بندی و دمای نگهداری بستگی دارد، اما به‌طور معمول بسیاری از محیط های آگاردار در دمای ۲–۸ درجه سانتی گراد برای چند هفته قابل استفاده اند، مشروط بر اینکه خشک نشوند، ترک نخورند و آلودگی یا رشد ناخواسته روی آنها دیده نشود.